Завантажити книгу "Клінічні лабораторні дослідження" (2.84Mb). Визначення білка (уніфікований метод Брандберга-Робертса-Стольникова) Якісна проба геллера при дослідженні сечі

Ти – не раб!
Закритий освітній курс для дітей еліти: "Справжнє облаштування світу".
http://noslave.org

Матеріал з Вікіпедії – вільної енциклопедії

Проба Геллера, на ім'я австр. патолога І. Ф. Геллера (J.F. Heller), поширена назва якісної реакції на білок у сечі. Проба має чутливість 0,033 г/л і використовується у клінічній діагностиці протеїнурії. Принцип виявлення білка заснований на його денатурації під впливом фактора, що денатурує, - концентрованої азотної кислоти або реактиву Ларіонової.

Слід зазначити, що в сечі завжди присутня деяка кількість білка, але, як правило, його концентрація в сечі здорової людини нижча за поріг чутливості якісної реакції і не виявляється простими методами. Для кількостей білка понад 0,033 г/л проба непридатна. При більш високих концентраціях необхідно розводити сечу або використовувати альбумінометр Есбаха.

Для визначення кількості загального білка в сечі використовують метод, заснований на пробі Геллера - метод Брандберга-Робертса-Стольникова (W. Roberts, 1830-1899, англ. терапевт). Методика передбачає розведення сечі до нижньої межі чутливості проби (0,033 г/л) та часу утворення кільця в 2-3 хвилини.

Хід виконання аналізу

Реактиви: концентрована (димна) азотна кислота або реактив Ларіонової. Досліджувана сеча має бути прозорою і мати кислу реакцію.

Приготування реактиву Ларіонової

Готують насичений розчин хлориду натрію (20-30 г солі розчиняють у 100 мл теплої води, дають відстоятись до охолодження). Надосадову рідину зливають і фільтрують. До 99 мл фільтрату додають 1 мл концентрованої азотної кислоти (можна замінити 2 мл соляної кислоти).

Техніка дослідження

У пробірку з 1-2 мл реактиву обережно по стінці нашаровують приблизно таку кількість сечі. За наявності білка, приблизно через 2-3 хвилини, на межі розділу рідин спостерігається помутніння - біле кільце з денатурованого білка.

Помилковопозитивний результат може з'явитися при використанні азотної кислоти за рахунок високої концентрації нуклеоальбумінів або солей уратів. У першому випадку воно зникає при легкому похитуванні пробірки, а в другому кільце розташовується значно вище за межі розділу середовищ і зникає при нагріванні; при повторенні проби з розведеною сечею кільце не утворюється. Іноді також з'являється коричневе пігментне кільце від окиснення урохрому азотною кислотою.

Використання реактиву Ларіонової, на відміну азотної кислоти, має ряд переваг: на межі нашарування не утворюється пігментних кілець, а позитивний результат дає більш чіткі білкові кільця.

Див. також

Напишіть відгук про статтю "Проба Геллера"

Посилання

Література

[[К:Вікіпедія:Статті без зображень (країна: Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. )]][[К:Вікіпедія:Статті без зображень (країна: Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. )]]Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. Проба Геллера Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. Проба Геллера Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. Проба Геллера Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. Проба Геллера Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. Проба Геллера Помилка Lua: callParserFunction: функція "#property" була недоступна. Проба Геллера

Уривок, що характеризує Проба Геллера

Мені було до дикості боляче і сумно за них, за себе, і за всіх, хто боровся, все ще вірячи, що можуть щось змінити... Та чи могли?.. Якщо всі, хто боровся, лише гинули, чи мала вона? сенс така війна?
Раптом переді мною виникла інша картина...
У тій же маленькій кам'яній «келлі», де на підлозі все ще лежало закривавлене тіло Магдалини, навколо неї, схиливши коліна, стояли Лицарі її Храму... Всі вони були незвично одягнені в білий – снігово-білий довгий одяг. Вони стояли навколо Магдалини, опустивши свої горді голови, а суворими, скам'янілими обличчями струмками бігли сльози... Першим піднявся Волхв, другом якого колись був Іван. Він обережно, ніби боячись зашкодити, опустив свої пальці в рану, і закривавленою рукою накреслив на грудях щось схоже на кривавий хрест... Другий зробив те саме. Так вони по черзі піднімалися, і благоговійно занурюючи руки у святу кров, малювали червоні хрести на своїх сніжно-білих шатах... Я відчувала, як у мене почало вставати дибки волосся. Це нагадувало якесь моторошне священнодійство, якого я поки що не могла зрозуміти...
– Навіщо вони це роблять, Північ?.. – тихо, наче боячись, що мене почують, пошепки запитала я.
– Це клятва, Ізидоро. Клятва вічної помсти... Вони присягнули кров'ю Магдалини – найсвятішою для них кров'ю – помститися за її смерть. Саме з того часу і носили Лицарі Храму білі плащі з червоними хрестами. Тільки майже ніхто зі сторонніх ніколи не знав їхнього справжнього значення... І всі чомусь дуже швидко «забули», що лицарі Храму до загибелі Магдалини одягалися у прості темно-коричневі балахони, не прикрашені ніякими хрестами. Лицарі Храму, як і катари, ненавиділи хрест у сенсі, у якому «шанує» його християнська церква. Вони вважали його підлим і злим знаряддям вбивства, знаряддям смерті. І те, що вони малювали на грудях кров'ю Магдалини, мало зовсім інше значення. Просто церква «перекроїла» повністю значення Лицарів Храму під свої потреби, як і решта, що стосується Радомира і Магдалини.
Так само, вже після смерті, вона оголосила вуличною жінкою, яка загинула Магдалину.
– так само заперечувала дітей Христа та його одруження з Магдалиною...
– так само знищила їх обох «в ім'я віри Христа», з якою вони обоє все життя люто боролися...
– так само знищила Катар, користуючись іменем Христа... ім'ям людини, Вірі та Знанню якої вони вчили...
– так само знищила і Тамплієрів (Лицарів Храму), оголосивши їх поплічниками диявола, обібгавши і обливши брудом їх діяння, і опішивши самого Магістра, який був прямим нащадком Радомира і Магдалини...
Позбавившись усіх, хто хоч якось міг вказати на ницість і підлість «святіших» дияволів Риму, християнська церква створила легенду, яку надійно підтвердила «безперечними доказами», яких ніхто ніколи чомусь не перевіряв, і нікому не спадало на думку хоч б подумати про те, що відбувається.

Визначення концентрації білка у сечі методом розведення.

Р-ви 50% р-р азотної к-ти чи р-в ларіонової. Хід визначення: в штатив ставлять ряд пробірак і наливають по 1 мл розчину азотної кислоти доб-ть 1 мл сечі нашаровують на реактив і засікають час, при появі кільця записуємо час появи кільця. Якщо кільце широке роблять розведення сечі.

4.Визначення концентрації білка в сечі з 3% сульфосаліцилової кислоти.

Р-ви: 3% сск, хлорид натрію 9%, ст р-р альбуміну 10%. У дослідну додають 3,75 мл 3% розчину сульфосаліцилової кислоти, контрольну 3,75 мл 0,9% розчину злодія хлориду натрію. Залишають на 5 хв., а потім фотометрують на ФЕК при довжині хвилі 590 - 650нм (помаранчевий або червоний світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 5мм досвід проти контролю. Розрахунок ведуть за калібрувальним графіком або таблиці. Принцип методузаснований на тому, що білок з сульфосаліци-ловою кислотою дає помутніння, інтенсивність якого прямо пропорційно концентрації білка.

5.Виявлення глюкози в сечі проба Гайнеса-Акімова. Принцип: Глюкоза при нагріванні в лужному середовищі відновлює дигідроксід міді (жовтого кольору) моногідроксід міді (оранжево-червоного кольору). Приготування реактиву: 1) 13,3 г хім. чистого кристалічного сульфату міді(СіSO 4 . 5 Н 2 Про) розчин. 400мл води. 2) 50г їдкого натру розчиняють у 400мл води. 3) 15г чистого гліцерину розводять у 200мл води. Змішують перший і другий розчини і відразу ж доливають третій. Реактив стійок. Хід визначення: У пробірку вносять 1 краплю сечі та 9 крапель реактиву і кип'ятять на водяній бані 1-2 хв. Позитивна проба: жовте або оранжеве забарвлення рідини або осаду.

6. Якісне визначення глюкози у сечі глюкооксидазним методом. Принцип методу: глюкоза окислюється в присутності глюкозооксидази, згідно реакції: Глюкоза + Про 2 гліконолантом + Н 2 Про 2 . Перекис Н, що утворюється, під дією перексидази окислює субстрат з утворенням забарвленого продукту.

Приливаємо та інкубуємо 15 хвилин при 37 0 С. Дивитись на КФК, кювета 5мм.

Потім проводять розрахунки за формулою: оп = Ext оп . Cст/Ect ст.

7.Виявлення кетонових тіл у сечі пробою Лестраде.На предметне скло наносять (на кінчику скальпеля) порошку або таблетку розчину Лестраде, а на нього 2-3 краплі сечі. За наявності кетонових тіл з'явиться фарбування від рожевого до фіолетового. Пробу оцінюють на білому тлі.

8. Виявлення кров'яного пігменту в сечі пробій з 5% спиртовим розчином амідопірину.

1.5% спиртовий розчин амідопірину (0,5 г амідопірину розчиняють у 10 мл спирту 96%) 2.3% розчин перекису водню 1,5 г гідропіриту розчиняють у 50 мл води) Хід методики: в пробірку наливають 2-3 мл оцтово -ефірної витяжки або збовтаної не фільтрованої сечі. додають 8-10 крапель 5% розчину амідопірину і 8-10 крапель 3% розчину перекису водню; фарбування.

Виявлення уробіліну в сечі пробою Нейбауера.

Заснована на кольоровій реакції уробіліногену з реактивом Ерліха, який складається з 2 г парадиметиламінобенальдегіду і 100 мл розчину хлористоводневої кислоти (200 г.л). Хід визначення. 1 мл сечі і на 1 мл розчину. Поява червоного цв. в перші 30 с вказує на підвищ. не можна нагрівати,т.к можна утворитися побічні комплексні з'єдн,альдегіду з порфіринами,індолом і лек.препаратами.

Виявлення білірубіну в сечі пробою Розіна.

Спиртовий р-р йоду (10г.л): 1 г кристалічного йоду розчиняють у циліндрі місткістю 100 мл у 20-30 мл 96 гр. спирту-ректифікату, а потім доб. доливають спиртом до мітки. Ход визначення. 4-5 мл досліджуваної сечі і обережно нашаровують на неї спиртовий розчин йоду (якщо сеча має низьку відносну щільність, то слід нашаровувати її на спиртовий розчин йоду). За наявності білірубіну на кордоні між рідинами обр. антипірину, а також при сод.в сечі кров'яного пігменту проба виявляється позитивною). У здорової людини ця проба негативна.

Дослідження сечі методом сухої хімії (монополітестами).

принцип. Метод заснований на дії, що надається білком на колір індикатора, що знаходиться в буферному розчині, внаслідок чого барвник змінює колір жовтого на синій.

Під час проведення реакції на присутність білка в сечі та визначення pH за допомогою індикаторного паперу рекомендується виконати такі вказівки:

1. Зібрати сечу в ретельно вимитий посуд.
2. Використовувати свіжозібрану сечу, що не містить консервантів.
3. Ретельно закрити пенал після вилучення необхідної кількості індикаторних смужок паперу.
4. Не захоплюйте пальцями індикаторні зони.
5. Використовувати лише у межах зазначеного на етикетці терміну придатності.
6. Дотримуватись правил зберігання індикаторного паперу.
7. Проводити оцінку результатів відповідно до вказівок, що є в інструкції.

Виконує аналіз сечі на аналізаторі сухої хімії сечі.

Хід визначення. З пеналу витягають смужку індикаторного паперу і занурюють її в сечу, що досліджується так, щоб одночасно змочити обидві індикаторні зони. Через 2-3 смужку поміщають на білу скляну пластинку. Негайно проводять оцінку pH, користуючись кольоровою шкалою, нанесеною на пеналі. Значення рН на кольоровій шкалі відповідають 6,0 (або менше); 7,0; 8,0; 9,0.

Підготовка сечі, приготування препаратів із осаду сечі мікроскопічного дослідження орієнтовним способом.

Мікроскопічне дослідження осаду сечі проводять орієнтовним методом при загальному аналізі та кількісним підрахунком формених елементів для більш точної оцінки ступеня луйкоцитурії та гематурії.

Правила підготовки осаду сечі мікроскопування.

Мікроскопічному дослідженню підлягає перша ранкова порція сечі.

Після попереднього перемішування беруть 10 мл сечі, центрифугують 10 хв при 1500 об/хв.

Потім центрифужну пробірку із сечею різким рухом перекидають, швидко зливають надосадову рідину в порожню банку.

Перемішують, поміщають краплю на предметне скло і обережно прикривають покривним.

Якщо осад складається з декількох шарів, готують препарат, а потім знову центрифугують і готують препарати з кожного шару окремо.

За відсутності видимого на око осаду краплю сечі наносять на предметне скло та мокроскопують.

На початку матеріал розглядають при малому збільшенні (окуляр 7-10, об'єктив 8), конденсор при цьому опускають, дещо звужують діафрагму, потім препарат детально вивчають при великому збільшенні (окуляр 10,7; об'єктив 40).

14.Кількісне дослідження осаду сечі за Нечипоренком.

Метод використовується при прихованих уповільнених запальних процесах (пієлонефрит, гломерулонефрит), прихована піурія. Для дослідження патологічного процесу у поступовій динаміці. Для оцінки ефективності лікування. Переваги методу:технічно простий, не вимагає великої кількості сечі і тривалість. його зберігання застосовується в амбулаторній практиці. Зобов. умови: ранкова сеча, середня порція, кисла р-ція (лужний може бути частковий розпад клітинних елементів). 1. Перемішують сечу.2.У мірну центрифужну пробірку поміщають 10 мл сечі і центрифугують 10 хв 1500 об/хв. 3. Після центрифу. відсмоктування. Піпеткою верхню частину рідини, залиш. рівно 1 мл осаду. 4.Осад ретельно перемішують і заповнюють камеру Горяєва. 5. Через 3-5 хв після заповнення, приступають до підрахунку формених елементів. 6.Підрахунок лейкоцитів, Er, циліндрів з окуляром 15 об'єктивом 8 при опущ. конденсорі, у 100 великих квадратах камери. Вважають окремо лейкоцити, Er, циліндри (рах. не менше 4 камер Горяєва) виводять середовищ. ариф. Х = А х 0,25 х 10 6 /л. Норма: лейк. 2-4х 10 6 /л, Er до 1 х 10 6 /л, циліндрів до 0,02 х 10 6 /л (один на 4 камери). Діти: лейк. до 2-4х 106/л, Er до 0,75х106/л, циліндрів до 0,02х106/л.

15. Дослідження сечі по Зимницькому

Цією пробою встановлюють здатність нирок концентр. і розводити сечу. Сутність проби закл. в динамічному визначенні відносної щільності і кількості сечі в трьохгодинних порціях протягом доби. Проведення проби: після випорожнення сечового міхура о 6 годині ранку в унітаз, пацієнт через кожні три години збирає сечу в окремі банки протягом доби. Усього 8 порцій. Хід дослідж.: 1. Доставл. Сечу розставляють по годинниках і в кожній порції визначають кількість і відносну щільність. 2. Порівнюють добову кількість сечі і кількість випитої рідини, щоб опред. % її виведення. 3. Обчислюють денний та нічний діурез, підсумовують, одержують добовий діурез. 4. Встановлюють діапазон коливань кіл-ва і відносні. щільності сечі на добу тобто. яка різниця між найменшою порцією та великою. Показ. проби у здоров. людей: 1. Добовий діурез 800-1500 мл. 2. Денний діурез значно переважає нічний. 3.Коливання обсягу сечі в окремих порціях значні (від 50 до 400 мл). 4. Коливання р від 1,003 до 1,028 має бути більше 0,008. При функції. недостатності нирок: гіпостенурія, гіпоізостенурія, ізостенурія, гіперстенурія, олігурія, анурія, ніктурія.

16. Опис загальних властивостей калу.

У нормі кал складається з продуктів секреції та екскреції травного тракту, залишків неперевар або частково перетравлення харчових продуктів, мікробної флори. Кількість калу 100-150 г. Консистенція-щільна. Форма-циліндрична. Запах-каловий звичайний. Колір коричневий. Р-ція-нейтральна, слаболужна або слабокисла (рН 6,5-7,0-7,5). Слизь відсутній. Кров-відсутня. Залишки неперетравленої їжі-відсутня.

Визначення ШОЕ.

Водний розчин цитрату натрію 5%, об'єм крові 1:4. Набирають цілий капіляр крові та змішують з цитратом натрію (25 поділів). Ставлять в апарат Панчекова на годину. Норма чоловік. 2-10 мм/год, жін. 2-15 мм/год. Прискорена ШОЕ-інф. запалився. процеси, лейкози, злоякісності. новоутворення. Уповільнення ШОЕ-збільшення вмісту альбумінів, жовчних кислот.

Фіксація мазків крові.

Захищає формені елементи крові від впливу води, що міститься в фарбах, під впливом якої в нефіксованих препаратах відбувається гемоліз еритроцитів і змінюється морфологія лейкоцитів. Фіксатор також викликає коагуляцію білків та закріплює мазок на склі. Фіксатори: метиловий спирт (3-5 хв), розчин еозинметиленового синього по Май-Грюнвальду, етиловий спирт 960 (30 хв), хлороформ (кілька секунд), формалін (1 хв), суміш Нікіфорова (20 хв). Фіксацію проводять у спеціальних контейнерах, опускаючи з кювету з фіксатором.

Виявлення білка в сечі пробою Геллера.

Р-ви 50% азотна к-та, р-в ларіонової. Хід визначення в пробірку 1-1,5 мл азотної кислоти або реактив ларіонової і по стінці наливають 1-1,5 мл сечі, за наявності білка з'явиться біле кільце, почуттів проби 0,033 г/л. Поява кільця через 2-3 хвилини

2.Виявлення білка в сечі з 20% сульфосаліцилової кислоти.

Р-в: р-р 20% сск: 20г сск розчиняють у 70 мл дис води і доливають до 100 мл. хід визначення: в 2 пробірки налити 2-3 мл центрифугір сечі слабокислої реакції, в 1 пробірку налити 3-4 краплі розчину, в 2 в неї доливають 2 мл дис води. за наявності білка в пробірці з реактивом з'явиться каламутність або випадають пластівці, контроль пробірки залишається прозорим. Мінімал кількість білка в цій пробі 0,015 г/л.

Невелика кількість білка в добовій сечі виявляється і у цілком здорових осіб, проте такі невеликі концентрації не виявляють у разових порціях методами, що використовуються в даний час. Приблизно 70% білків сечі здорової людини посідає частку уромукоида - білка, що є продуктом ниркової тканини; таким чином, частка гломерулярного білка в сечі здорових людей є мізерно малою і протеїнурія в нормі становить 50-150 мг/сут, причому більшість білків сечі ідентично сироватковим.

Прийнято розрізняти такі форми протеїнурії залежно від місця виникнення: - преренальну, пов'язану з посиленим розпадом білка тканин, вираженим гемолізом; ренальну, обумовлену патологією нирок, яка може бути розділена на клубочкову та канальцеву; постренальну, пов'язану з патологією сечовивідних шляхів і найчастіше зумовлену запальною ексудацією.

Залежно від тривалості існування виділяють постійну протеїнурію, що існує протягом багатьох тижнів і навіть років, і минущу, що з'являється періодично, іноді навіть за відсутності патології нирок, наприклад, при лихоманці та вираженій інтоксикації.
Доцільно розрізняти варіабельність протеїнурії: при добовій втраті білка до 1 г – помірну, від 1 до 3 г – середню та більше 3 г – виражену.

Виявлення в сечі білків з відносно великою молекулярною масою свідчить про відсутність вибірковості ниркового фільтра та виражене його ураження. У цих випадках говорять про низьку селективність протеїнурії. Тому в даний час широкого поширення набули визначення білкових фракцій сечі. Найбільш точні методи електрофорезу в крохмальному та поліакриламідному гелі. За результатами, отриманими цими методами, можна судити про селективність протеїнурії.

Більшість якісних та кількісних методів визначення білка в сечі ґрунтуються на його коагуляції в обсязі сечі або на межі середовищ (сечі та кислоти); якщо є спосіб виміряти інтенсивність коагуляції, проба стає кількісною.

Уніфікована проба з сульфосаліциловою кислотою:

Необхідний реактив:

20%-ний розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід дослідження:

У 2 пробірки наливають по 3 мл профільтрованої сечі.
У дослідну пробірку додають 6-8 крапель реактиву. На темному тлі порівнюють контрольну пробірку з дослідною. Помутніння в дослідній пробірці свідчить про наявність білка, пробу вважають позитивною.

Якщо реакція сечі лужна, перед дослідженням її підкислюють 2-3 краплями 10%-ного розчину оцтової кислоти.

Уніфікований метод Брандберга-Робертса-Стольникова:

В основу методу покладено кільцеву пробу Геллера, яка полягає в тому, що на межі азотної кислоти та сечі за наявності білка відбувається його коагуляція та з'являється біле кільце.

Необхідний реактив:

30%-ний розчин азотної кислоти (відносна щільність 1,2) або реактив Ларіонової. Приготування реактиву Ларіонової: 20-30 г натрію хлориду розчиняють при нагріванні в 100 мл дистильованої води, дають охолонути, фільтрують. До 99мл фільтрату доливають 1мл концентрованої азотної кислоти.

Хід дослідження:

У пробірку наливають 1-2 мл азотної кислоти (або реактиву Ларіонової) та обережно, по стінці пробірки, нашаровують таку ж кількість профільтрованої сечі.
Поява тонкого білого кільця на межі двох рідин між 2 і 3 хвилиною вказує на наявність білка в концентрації приблизно 0,033 г/л. Якщо кільце з'являється раніше 2 хв після нашарування, сечу слід розвести водою і провести повторне нашарування вже розведеної сечі. Ступінь розведення сечі підбирають залежно від виду кільця, тобто. його ширини, компактності та часу появи. При ниткоподібному кільці, що з'явилося раніше 2 хв, сечу розводять у 2 рази, при широкому – у 4 рази, при компактному – у 8 разів тощо. Концентрацію білка при цьому обчислюють множенням 0,033 на ступінь розведення і виражають у грамах на 1 л (г/л).

Іноді біле кільце виходить за наявності великої кількості уратів. На відміну від білкового кільця, уратне з'являється трохи вище межі між двома рідинами і розчиняється при легкому нагріванні.

Кількісне визначення білка в сечі за помутнінням, що утворюється при додаванні сульфосаліцилової кислоти:

Принцип методу:

Інтенсивність помутніння при коагуляції білка сульфосаліцилової кислоти пропорційна його концентрації.

Необхідні реактиви:

1.
3%-ний розчин сульфосаліцилової кислоти.

2. 0,9% розчин хлориду натрію.

3. Стандартний розчин альбуміну - 1%-ний розчин (1 мл розчину, що містить 10 мг альбуміну): 1 г ліофілізованого альбуміну (з людської або бичачої сироватки) розчиняють у невеликій кількості 0,9%-ного розчину хлориду натрію в колбі місткістю 1 мл, а потім доводять до мітки тим самим розчином. Реактив стабілізують додаванням 1 мл 5% розчину азиду натрію (NaN3). При зберіганні у холодильнику реактив придатний протягом 2 місяців.

Спеціальне обладнання – фотоелектроколориметр.

Хід дослідження:

У пробірку вносять 1,25 мл профільтрованої сечі, доливають до 5 мл 3%-ним розчином сульфосаліцилової кислоти, перемішують. Через 5 хв вимірюють на фотоелектроколориметр при довжині хвилі 590-650 нм (помаранчевий або червоний світлофільтр) проти контролю в кюветі довжиною оптичного шляху 5 мм. Контролем служить пробірка, в якій до 1,25 мл профільтрованої сечі долили до 5 мл 0,9% розчин хлориду натрію. Розрахунок ведуть за калібрувальним графіком, для побудови якого зі стандартного розчину готують розведення, як зазначено в таблиці.

З кожного отриманого розчину беруть 1,25 мл і обробляють як досвідчені проби.

Прямолінійна залежність при побудові калібрувального графіка зберігається до 1 г/л. При більш високих концентраціях пробу слід розводити та враховувати розведення під час розрахунку.

Хибнопозитивні результати можуть бути отримані за наявності сечі контрастних речовин, що містять органічний йод. Тому тест не можна використовувати в осіб, які приймають препарати йоду; хибнопозитивний результат може бути також обумовлений прийомом сульфаніламідних препаратів, великих доз пеніциліну та при високих концентраціях у сечі сечової кислоти.

Біуретовий метод:

Принцип методу:

Пептидні зв'язки білка з солями міді у лужній з утворюють комплекс фіолетового кольору. Білки попередньо осаджують трихлороцтовою кислотою.

Необхідні реактиви:

1. 10%-ний розчин трихлороцтової кислоти.
2. 20% розчин міді (CuSO4∙5H2O).
3. 3%-ний розчин NaOH.

Хід дослідження:

До 5 мл сечі, взятої із добової кількості, додають 3 мл розчину трихлороцтової кислоти, центрифугують до постійного об'єму осаду. Надосадову рідину відсмоктують піпеткою, потім осад розчиняють в 5 мл розчину NaОН. До розчину додають 0,25 мл CuSO4, суміш перемішують та центрифугують. Надосадову рідину фотометрируют при довжині хвилі 540 нм у кюветі з довжиною оптичного шляху 10 мм проти дистильованої води. Концентрацію білка розраховують по калібрувальної кривої, при побудові якої осі ординат відкладають концентрацію білка (г/л), але в осі абсцис - оптичну щільність в одиницях екстинкції. За отриманою концентрацією розраховують добову втрату білка із сечею.

За допомогою індикаторного паперу (смужок):

Білок може бути виявлений за допомогою індикаторного паперу (смужок), що випускаються фірмами "Albuphan", "Ames" (Англія), "Albustix", "Boehringer" (Німеччина), "Comburtest" та ін.

Принцип заснований на феномен так званої протеїнової помилки деяких кислотно-лужних індикаторів. Індикаторна частина паперу просочена тетрабромфеноловим синім та цитратним буфером. При зволоженні паперу буфер розчиняється та забезпечує відповідний рН для реакції індикатора.

При 3,0-3,5 аміногрупи білків реагують з індикатором і змінюють його спочатку жовте забарвлення на зеленувато-синю, після чого, порівнюючи з кольоровою шкалою, можна орієнтовно оцінити концентрацію білка в сечі, що досліджується. Основною причиною правильної роботи індикаторних смужок є забезпечення pH в діапазоні 3,0-3,5 для перебігу реакції.

Якщо папір перебуває у контакті з досліджуваної сечею довше експозиції, зазначеної в інструкції, то цитратний буфер у ній розчиняється, і тоді індикатор реагує на рН сечі, тобто. дає хибнопозитивну реакцію. У зв'язку з тим, що ємність буфера обмежена, то навіть при дотриманні методичних вказівок у пробах занадто лужної сечі (pH > 6,5) виходять хибнопозитивні результати, а в пробах занадто кислої сечі (рН
Число реагують аміногруп у складі окремих білків по-різному, тому альбуміни реагують у 2 рази інтенсивніше, ніж така ж кількість γ-глобулінів (білок Бенс-Джонса, парапротеїни), і набагато інтенсивніше, ніж глікопротеїди. Однак при великій кількості слизу з високим вмістом глікопротеїдів (при запаленні сечовивідних шляхів) пласти слизу, що осідають на індикаторній смужці, можуть давати хибнопозитивні результати.

Чутливість окремих виробничих серій індикаторного паперу, як і окремих видів паперу, що випускаються однією і тією ж фірмою, може бути різною, тому до кількісної оцінки білка цим методом слід ставитися обережно. Визначення добової втрати білків із сечею за допомогою індикаторного паперу неможливе. Таким чином, індикаторний папір поступається хімічним пробам, в першу чергу пробі з сульфосаліцилової кислоти, хоча дає можливість швидкого дослідження серії зразків.

Виявлення в сечі білка Бенс-Джонса:

Білок Бенс-Джонса може виділятися із сечею при мієломній хворобі, макроглобулінемії Вальденстрему.

Дослідження доцільно проводити лише за позитивної проби з сульфосаліциловою кислотою. Індикаторний папір для виявлення білка Бенс-Джонса непридатний.

Принцип:

Заснований на реакції термопреципітації. Методи, за допомогою яких оцінюють розчинення білка Бенс-Джонса при температурі 100 °С або повторне осадження при подальшому охолодженні, ненадійні, так як далеко не всі білкові тіла Бенс-Джонса мають відповідні властивості. Найбільш достовірно виявлення цього парапротеїну осадженням його при температурі 40-60 ° С, але і в цих умовах осадження може не статися в занадто кислій (рН 6,5) сечі, при відносній низькій щільності сечі і при низькій концентрації білка Бенс-Джонса.

Необхідні реактиви:

2 Мацетатний буфер рН 4,9.

Хід дослідження:

Профільтровану сечу у кількості 4 мл змішують з 1 мл буфера та зігрівають протягом 15 хв на водяній бані при температурі 56 °С. За наявності білків Бенс-Джонса протягом 2 хв з'являється виражений осад, при концентрації білка Бенс-Джонса менше 3 г/л проба може вийти негативною. Насправді це зустрічається дуже рідко, оскільки переважно концентрація білка Бенс-Джонса в сечі значна.

З повною достовірністю білок Бенс-Джонса може бути виявлений імуноелектрофоретичним дослідженням при використанні специфічних сироваток проти важких та легких ланцюгів імуноглобулінів.

Визначення альбумоз (протеоз):

Альбумози - це продукти розщеплення білків, принцип визначення яких ґрунтується на тому, що вони не згортаються при кип'ятінні, але дають позитивну біуретову реакцію і висолюються деякими солями, особливо сульфатом амонію та ацетатом цинку в кислому середовищі.

Нормальна сеча альбумоз не містить. Сліди можуть бути у нормальній сечі у разі домішки насіннєвої рідини. У патології альбумози можуть зустрічатися в сечі при гарячкових станах, переливанні крові та плазми, розсмоктуванні ексудатів та транссудатів, розпаді пухлин.

Необхідні реактиви:

1. Насичений розчин хлориду натрію.
2. Концентрований розчин їдкого натру.
3. Слабкий розчин сульфату міді (майже безбарвний).

Хід дослідження:

До сечі, підкисленої оцтовою кислотою, додають насичений розчин натрію хлориду (1/3 об'єму), кип'ятять і гарячу рідину фільтрують. Альбумози проходять у фільтрат, в якому їхню присутність визначають біуретовою реакцією. До фільтрату додають 1/2 об'єму концентрованого розчину їдкого натру та кілька крапель слабкого розчину сульфату міді. При позитивній пробі виходить червоно-фіолетове забарвлення.

При позитивній пробі із сульфосаліциловою кислотою сечу нагрівають. Якщо каламутно зникає і знову з'являється при охолодженні, це означає, що сеча містить альбумози або білкове тіло Бенс-Джонса.

Проба має чутливість 0,033 г/л і використовується у клінічній діагностиці протеїнурії. Принцип виявлення білка заснований на його денатурації під впливом фактора, що денатурує, - концентрованої азотної кислоти або реактиву Ларіонової.

Слід зазначити, що в сечі завжди присутня деяка кількість білка, але, як правило, його концентрація в сечі здорової людини нижча за поріг чутливості якісної реакції і не виявляється простими методами. Для кількостей білка понад 0,033 г/л проба непридатна. При більш високих концентраціях необхідно розводити сечу або використовувати альбумінометр Есбаха.

Для визначення кількості загального білка в сечі використовують метод, заснований на пробі Геллера - метод Брандберга-Робертса-Стольникова (W. Roberts, 1830-1899, англ. терапевт). Методика передбачає розведення сечі до нижньої межі чутливості проби (0,033 г/л) та часу утворення кільця в 2-3 хвилини.

Хід виконання аналізу

Реактиви: концентрована (димна) азотна кислота або реактив Ларіонової. Досліджувана сеча має бути прозорою і мати кислу реакцію.

Приготування реактиву Ларіонової

Готують насичений розчин хлориду натрію (20-30 г солі розчиняють у 100 мл теплої води, дають відстоятись до охолодження). Надосадову рідину зливають і фільтрують. До 99 мл фільтрату додають 1 мл концентрованої азотної кислоти (можна замінити 2 мл соляної кислоти).

Техніка дослідження

У пробірку з 1-2 мл реактиву обережно по стінці нашаровують приблизно таку кількість сечі. За наявності білка, приблизно через 2-3 хвилини, на межі розділу рідин спостерігається помутніння - біле кільце з денатурованого білка.

Помилковопозитивний результат може з'явитися при використанні азотної кислоти за рахунок високої концентрації нуклеоальбумінів або солей уратів. У першому випадку воно зникає при легкому похитуванні пробірки, а в другому кільце розташовується значно вище за межі розділу середовищ і зникає при нагріванні; при повторенні проби з розведеною сечею кільце не утворюється. Іноді також з'являється коричневе пігментне кільце від окиснення урохрому азотною кислотою.

Використання реактиву Ларіонової, на відміну азотної кислоти, має ряд переваг: на межі нашарування не утворюється пігментних кілець, а позитивний результат дає більш чіткі білкові кільця.

Див. також

Напишіть відгук про статтю "Проба Геллера"

Посилання

Література

До:Вікіпедія:Статті без зображень (тип: не вказано)

Уривок, що характеризує Проба Геллера

Граф знову пішов за перегородку та ліг. Графіня підійшла до Наташі, доторкнулася перевернутою рукою до її голови, як це вона робила, коли дочка її була хвора, потім доторкнулася до її чола губами, ніби для того, щоб дізнатися, чи є жар і поцілувала її.
- Ти змерзла. Ти вся тремтиш. Ти б лягала, – сказала вона.
- Лягати? Так, добре, я ляжу. Я зараз ляжу, - сказала Наталка.
З того часу, як Наташі цього ранку сказали про те, що князь Андрій важко поранений і їде з ними, вона тільки в першу хвилину багато запитувала про те, куди? як? чи небезпечно його поранено? і чи можна їй бачити його? Але після того як їй сказали, що бачити його їй не можна, що він поранений важко, але що життя його не в небезпеці, вона, очевидно, не повіривши тому, що їй говорили, але переконавшись, що хоч би скільки вона говорила, їй будуть відповідати те саме, перестала питати і говорити. Усю дорогу з великими очима, які так знала і яких виразів так боялася графиня, Наталка сиділа нерухомо в кутку карети і так само сиділа тепер на лаві, на яку сіла. Що то вона замислювала, що то вона вирішувала чи вже вирішила у своєму розумі тепер, - це знала графиня, але що це таке було, вона не знала, і це щось лякало і мучило її.
- Наташа, роздягнися, голубонько, лягай на мою постіль. (Тільки графині однієї була постелена постіль на ліжку; m me Schoss та обидві панянки мали спати на підлозі на сіні.)
- Ні, мамо, я ляжу тут, на підлозі, - сердито сказала Наталка, підійшла до вікна і відчинила його. Стогін ад'ютанта з відкритого вікна почувся виразніше. Вона висунула голову в сире повітря ночі, і графиня бачила, як її тонкі плечі тремтіли від ридання і билися об раму. Наталя знала, що стогнав не князь Андрій. Вона знала, що князь Андрій лежав у тому зв'язку, де вони були, в іншій хаті через сіни; але цей страшний стогін змусив заридати її. Графиня переглянулась із Сонею.
- Лягай, голубонько, лягай, мій друже, - сказала графиня, злегка торкаючись рукою до плеча Наталки. - Ну, лягай же.
- Ах, так ... Я зараз, зараз ляжу, - сказала Наташа, поспішно роздягаючись і обриваючи зав'язки спідниць. Скинувши сукню і вдягнувши кофту, вона, підгорнувши ноги, сіла на підготовлену на підлозі ліжко і, перекинувши через плече наперед свою коротку тонку косу, почала переплітати її. Тонкі довгі звичні пальці швидко, спритно розбирали, плели, зав'язували косу. Голова Наташі звичним жестом поверталася то в один, то в інший бік, але очі, гарячково відкриті, нерухомо дивилися прямо. Коли нічний костюм було закінчено, Наталка тихо опустилася на простирадло, послане на сіно з краю від дверей.
- Наташа, ти в середину ляж, - сказала Соня.
– Ні, я тут, – промовила Наталка. - Та лягайте ж, - додала вона з досадою. І вона закопалася обличчям у подушку.

Кільцева проба Геллера допомагає проаналізувати білкову складову сечі. Цей метод, розроблений Йосипом Геллером, базується на фізико-хімічному процесі злипання. Для сечі потрібен певний стан: при дослідженні потрібен прозорий зразок, який має кислу реакцію.

Для дослідження використовують концентрат азотної кислоти HNO3. Також під даний метод підійде реактив Ларіонової. Щоб зробити його, готується розчин хлористого натрію в концентрованому стані: двадцять п'ять мг солі додають у сто мл води.

Далі рідину нагрівають, при цьому відбувається повне розчинення солі. Після того, як розчин остигає, надосадову складову видаляють і дев'яносто дев'ять мілілітрів об'єднують з одним мілілітром концентрату HNO3. Його також можна замінити двома мл концентрату хлористоводневої кислоти.

Алгоритм проведення

Для проби Геллера буде потрібна пробірка, в яку міститься реактив в обсязі від одного до двох мілілітрів. Далі дуже обережно по стінці судини додається сеча, що досліджується, в рівній пропорції з реактивом. По закінченню трьох хвилинвзаємодія присутність білка виявиться у вигляді каламутної прикордонної лінії між сечею та реактивом. Це кільце і є білковим денатуратом.

Помилковий позитивний ефект вивчення може виникнути у разі застосування азотної кислоти, а також при великій кількості нуклеоальбумінів або солей уратів. У першій ситуації кільце розчиняється, якщо злегка струсити пробірку. Друга ситуація передбачає наявність кільця, яке буде локалізуватися трохи вище риси, що розділяє. Воно розчиняється у разі підвищення температури рідини. У деяких випадках виникає кільце коричневого забарвлення, це результат окиснення урохрому азотної складової.

Порівнюючи ефект від застосування HNO3 та реактиву Ларіонової, хочеться відзначити другий варіант як точніший. Він має низку переваг:

• Реактив Ларіонова не дає при аналізі пігментні кільця.
• Білкові кільця виявлені чіткіше, ніж з використанням методу Геллера.
• Зберігається азотна кислота.
• Реактив не такий небезпечний і, опиняючись на тканині, не спалює її.

Мінуси під час використання проби

1. Використання проби Геллера - досить складний процес, для якого потрібно багато часу, а також концентрат азотної кислоти.
2. Може виникати пігментне кільце коричневого забарвлення, що перешкоджає виявленню білка.
3. У матеріалі, в якому є сіль сечової кислоти, може утворюватися біле кільце, що розташовується значно вище за лінію, яка розділяє рідини.
4. Також дослідження здатне давати хибні позитивні результати у разі великої кількості сечової кислоти.

Альтернатива

Швидкий і простий спосіб визначення білка в сечі – за допомогою спеціального паперу, який є індикатором.

У цьому варіанті дослідження в матеріал занурюється паперова смужка, яка містить в собі особливе просочення, завдяки чому індикаторний папір при контакті з сечею набуває кольору в діапазоні від жовтого до синього. Відтінок показує концентрацію білка. Існує шкала, за якою можна зробити цей висновок.

Щоб результат був максимально точним, слід дотримуватися деяких правил:

• рН матеріалу повинен перебувати на позначці від 3,0 до 3,5. Велика кількість лугу дасть хибний позитивний результат, а у разі великої кількості кислоти у сечі – хибний негативний.
• Паперовий індикатор не повинен контактувати з матеріалом більше за певний час. Інакше результат буде необ'єктивним.
• Також при дуже великій кількості слизу може бути хибний позитивний результат.
• Залежно від паперу та його виробника чутливість індикатора може бути різною. Отже, не слід повністю покладатися на цей тест щодо вмісту білка в сечі.
• Добова сеча неспроможна показати кількість білка.