Скачать книгу "Клинические лабораторные исследования" (2.84Mb). Определение белка (унифицированный метод Брандберга—Робертса—Стольникова) Качественная проба геллера при исследовании мочи

Ты - не раб!
Закрытый образовательный курс для детей элиты: "Истинное обустройство мира".
http://noslave.org

Материал из Википедии - свободной энциклопедии

Проба Геллера , по имени австр. патолога И. Ф. Геллера (J.F. Heller), распространенное название качественной реакции на белок в моче . Проба имеет чувствительность 0,033 г/л и используется в клинической диагностике протеинурии . Принцип выявления белка основан на его денатурации под воздействием денатурирующего фактора - концентрированной азотной кислоты или реактива Ларионовой .

Следует отметить, что в моче всегда присутствует некоторое количество белка, но, как правило, его концентрация в моче здорового человека ниже порога чувствительности качественной реакции и не выявляется простыми методами. Для количеств белка свыше 0,033 г/л проба непригодна. При более высоких концентрациях необходимо разбавлять мочу или использовать альбуминометр Эсбаха.

Для определения количества общего белка в моче используются метод, основанный на пробе Геллера - метод Брандберга-Робертса-Стольникова (W. Roberts, 1830-1899, англ. терапевт). Методика предполагает разведение мочи до нижнего предела чувствительности пробы (0,033 г/л) и времени образования кольца в 2-3 минуты.

Ход выполнения анализа

Реактивы: концентрированная (дымящаяся) азотная кислота или реактив Ларионовой. Исследуемая моча должна быть прозрачной и иметь кислую реакцию.

Приготовление реактива Ларионовой

Приготавливают насыщенный раствор хлорида натрия (20-30 г соли растворяют в 100 мл теплой воды, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают и фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты (можно заменить 2 мл соляной кислоты).

Техника исследования

В пробирку с 1-2 мл реактива осторожно по стенке наслаивают примерно такое же количество мочи. При наличии белка, примерно через 2-3 минуты, на границе раздела жидкостей наблюдается помутнение - белое кольцо из денатурировашего белка.

Ложноположительный результат может появиться при использовании азотной кислоты, за счет высокой концентрации нуклеоальбуминов или солей уратов. В первом случае оно исчезает при легком покачивании пробирки, а во втором кольцо располагается значительно выше границы раздела сред и исчезает при нагревании; при повторении пробы с разбавленной мочой кольцо не образуется. Иногда также появляется коричневатое пигментное кольцо от окисления урохрома азотной кислотой.

Использование реактива Ларионовой, в отличие от азотной кислоты, имеет ряд преимуществ: на границе наслоения не образуется пигментных колец, а положительный результат дает более четкие белковые кольца.

См. также

Напишите отзыв о статье "Проба Геллера"

Ссылки

Литература

[[К:Википедия:Статьи без изображений (страна: Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. )]][[К:Википедия:Статьи без изображений (страна: Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. )]]Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. Проба Геллера Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. Проба Геллера Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. Проба Геллера Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. Проба Геллера Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. Проба Геллера Ошибка Lua: callParserFunction: function "#property" was not found. Проба Геллера

Отрывок, характеризующий Проба Геллера

Мне было до дикости больно и грустно за них, за себя, и за всех, кто боролся, всё ещё веря, что могут что-либо изменить... Да могли ли?.. Если все, кто боролся, лишь погибали, имела ли смысл такая война?..
Вдруг прямо передо мной возникла другая картина...
В той же маленькой каменной «келье», где на полу всё ещё лежало окровавленное тело Магдалины, вокруг неё, преклонив колени, стояли Рыцари её Храма... Все они были непривычно одеты в белое – снежно белые длинные одежды. Они стояли вокруг Магдалины, опустивши свои гордые головы, а по суровым, окаменевшим лицам ручьями бежали слёзы... Первым поднялся Волхв, другом которого когда-то был Иоанн. Он осторожно, будто боясь повредить, опустил свои пальцы в рану, и окровавленной рукой начертал на груди что-то, похожее на кровавый крест... Второй сделал то же самое. Так они поочерёдно поднимались, и благоговейно погружая руки в святую кровь, рисовали красные кресты на своих снежно-белых одеждах... Я чувствовала, как у меня начали вставать дыбом волосы. Это напоминало какое-то жуткое священнодействие, которого я пока ещё не могла понять...
– Зачем они это делают, Север?.. – тихо, будто боясь, что меня услышат, шёпотом спросила я.
– Это клятва, Изидора. Клятва вечной мести... Они поклялись кровью Магдалины – самой святой для них кровью – отомстить за её смерть. Именно с тех пор и носили Рыцари Храма белые плащи с красными крестами. Только почти никто из посторонних никогда не знал их истинного значения... И все почему-то очень быстро «позабыли», что рыцари Храма до гибели Магдалины одевались в простые тёмно-коричневые балахоны, не «украшенные» никакими крестами. Рыцари Храма, как и катары, ненавидели крест в том смысле, в котором «почитает» его христианская церковь. Они считали его подлым и злым орудием убийства, орудием смерти. И то, что они рисовали у себя на груди кровью Магдалины, имело совершенно другое значение. Просто церковь «перекроила» полностью значение Рыцарей Храма под свои нужды, как и всё остальное, касающееся Радомира и Магдалины....
Точно так же, уже после смерти, она во всеуслышание объявила погибшую Магдалину уличной женщиной...
– так же отрицала детей Христа и его женитьбу на Магдалине...
– так же уничтожила их обоих «во имя веры Христа», с которой они оба всю жизнь яростно боролись...
– так же уничтожила Катар, пользуясь именем Христа... именем человека, Вере и Знанию которого они учили...
– так же уничтожила и Тамплиеров (Рыцарей Храма), объявив их приспешниками дьявола, оболгав и облив грязью их деяния, и опошлив самого Магистра, являвшегося прямым потомком Радомира и Магдалины...
Избавившись от всех, кто хоть как-то мог указать на низость и подлость «святейших» дьяволов Рима, христианская церковь создала легенду, которую надёжно подтвердила «неоспоримыми доказательствами», коих никто никогда почему-то не проверял, и никому не приходило в голову хотя бы подумать о происходящем.

Определение концентрации белка в моче методом разведения.

Р-вы 50% р-р азотной к-ты или р-в ларионовой. Ход определения: в штатив ставят ряд пробирак и наливают по 1 мл р-ра азотной к-ты доб-ть 1 мл мочи наслаивают на реактив и засекают время, при появлении кольца записываем время появления кольца. Если кольцо широкое делают разведение мочи.

4.Определение концентрации белка в моче с 3% сульфосалициловой кислотой.

Р-вы: 3% сск, хлорид натрия 9%, ст р-р альбумина 10%.Ход определения: В две мерные центрифужные пробирки «О» – опыт и «К» - контроль помещают по 1,25мл прозрачной мочи. В опытную прибавляют 3,75мл 3% раствора сульфосалициловой кислоты, в контрольную 3,75мл 0,9% раст-вора хлорида натрия. Оставляют на 5 мин., а затем фотометрируют на ФЭКе при длине во-лны 590 – 650нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5мм опыт против контроля. Расчет ведут по калиб-ровочному графику ил таблице. Принцип метода основан на том, что белок с сульфосалици-ловой кислотой дает помутне-ние, интенсивность которого прямо пропорционально концентрации белка.

5.обнаружение глюкозы в моче проба Гайнеса-Акимова. Принцип : Глюкоза при нагревании в щелочной среде восстанавливает дигидроксид меди (желтого цвета) в моногидроксид меди (оранжево-красного цвета).Приготовление реактива : 1) 13,3 г хим. чистого кристаллического сульфата меди(СиSO 4 . 5 Н 2 О) раствор. в 400мл воды. 2) 50г едкого натра растворяют в 400мл воды. 3) 15г чистого глицерина разводят в 200мл воды. Смешивают первый и второй растворы и тотчас приливают третий. Реактив стоек. Ход определения : В пробирку вносят 1 каплю мочи и 9 капель реактива и кипятят на водяной бане 1-2 мин. Положительная проба : желтая или оранжевая окраска жидкости или осадка.

6. Качественное определение глюкозы в моче глюкооксидазным методом. Принцип метода : глюкоза окисляется в присутствии глюкозооксидазы, согласно реакции: Глюкоза + О 2 гликонолантом + Н 2 О 2 .Образующаяся перекись Н под действием перексидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта.

Приливаем и инкубируем 15 минут при 37 0 С. Смотреть на КФК, кювета 5мм.

Затем производят расчёты по формуле: С оп = Ext оп . Cст/ Ect cт.

7.Обнаружение кетоновых тел в моче пробой Лестраде. На предметное стекло наносят (на кончике скальпеля) порошка или таблетку р-ра Лестраде, а на него 2-3 капли мочи. При наличии кетоновых тел появится окраска от розового до фиолетового. Пробу оценивают на белом фоне.

8.Обнаружение кровяного пигмента в моче пробой с 5 % спиртовым раствором амидопирина.

1.5% спиртовой р-р амидопирина(0,5 г амидопирина растворяют в 10 мл спирта 96%)2.3% р-р перекиси водорода 1,5 г гидропирита растворяют в 50 мл воды)Ход методики:в пробирку наливают 2-3 мл уксусно-эфирной вытяжки или взболтанной не фильтрованной мочи.добавляют 8-10 капель 5 % р-ра амидопирина и 8-10 капель 3% р-ра перекиси водорода;учитывают результат не позднее 2-3 мин.Проба считается положительной при наличии серо-фиолетового окрашивания.

Обнаружение уробилина в моче пробой Нейбауэра.

Основана на цветной реакции уробилиногена с реактивом Эрлиха,который сост.из 2 г парадиметиламинобенальдегида и 100 мл р-ра хлористоводородной к-ты(200 г.л).Ход определения.К нескольким мл свежевыделенной мочи приливают несколько капель р-ра Эрлиха(на 1 мл мочи и на 1 мл р-ра.Появление красного цв.в первые 30 с указывает на повыш.сод.уробилиногена.В норме окраска появляется позже или вообще отсут.При стоянии мочи уробилиноген превращается в уробилин и проба может быть ложноотрицательной.Пробу нельзя нагревать,т.к можно могут образоваться побочные комплексные соед,альдегида с порфиринами,индолом и лек.препаратами.

Обнаружение билирубина в моче пробой Розина.

Спиртовой р-р йода(10г.л):1 г кристаллического йода растворяют в цилиндре вместимостью 100 мл в 20-30 мл 96 гр.спирта-ректификата,а затем доб.доливают спиртом до метки.Ход определения.В хим.пробирку наливают 4-5 мл исследуемой мочи и осторожно наслаивают на нее спиртовой р-р йода(если моча имеет низкую относительную плотность,то следует наслаивать ее на спиртовой р-р йода).При наличии билирубина на границе между жидкостями обр.зелёное кольцо(при приёме антипирина,а также при сод.в моче кровяного пигмента проба оказывается положительной).У здорового человека эта проба отрицательна.

Исследование мочи методом сухой химии (моно- политестами).

Принцип. Метод основан на воздействии, оказываемом белком на цвет индикатора, находящегося в буферном растворе, в результате чего краситель изменяет цвет с желтого на синий.

При проведении реакции на присутствие белка в моче и определении pH с помощью индикаторной бумаги рекомендуется выполнить следующие указания:

1. Собрать мочу в тщательно вымытую посуду.
2. Использовать свежесобранную, не содержащую консервантов мочу.
3. Тщательно закрыть пенал после извлечения из него необходимого количества индикаторных полосок бумаги.
4. Не захватывать пальцами индикаторные зоны.
5. Использовать только в пределах указанного на этикетке срока годности.
6. Соблюдать правила хранения индикаторной бумаги.
7. Проводить оценку результатов в соответствии с указаниями, имеющимеся в инструкции.

Выполнение анализа мочи на анализаторе сухой химии мочи.

Ход определения. Из пенала извлекают полоску индикаторной бумаги и погружают ее в исследуемую мочу так, чтобы одновременно смочить обе индикаторные зоны. Через 2-3 с полоску помещают на белую стеклянную пластинку. Немедленно проводят оценку pH, пользуясь цветной шкалой, нанесенной на пенале. Значение pH на цветной шкале соответствуют 6,0 (или меньше); 7,0; 8,0; 9,0.

Подготовка мочи, приготовление препаратов из осадка мочи микроскопического исследования ориентировочным способом.

Микроскопическое исследование осадка мочи проводят ориентировочным методом при общем анализе и количественным подсчетом форменных элементов для более точной оценки степени луйкоцитурии и гематурии.

Правила подготовки осадка мочи для микроскопирования.

Микроскопическому исследованию подлежит первая утренняя порция мочи.

После предварительного перемешивания берут 10 мл мочи, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин.

Затем центрифужную пробирку с мочой резким движением опрокидывают, быстро сливают надосадочную жидкость в пустую банку.

Перемешивают, каплю помещают на предметное стекло и осторожно прикрывают покровным.

Если осадок состоит из нескольких слоев, то готовят препарат, а затем вновь центрифугируют и готовят препараты из каждого слоя в отдельности.

При отсутствии видимого на глаз осадка каплю мочи наносят на предметное стекло и мокроскопируют.

В начале материал рассматривают при малом увеличении (окуляр 7-10, обьектив 8), конденсор при этом опускают, несколько суживают диафрагму, затем препарат детально изучают при большом увеличении (окуляр 10,7 ; обьектив 40).

14.Количественное исследование осадка мочи по Нечипоренко.

Метод используется при скрытых вялотекущих воспалительных процессах (пиелонефрит, гломерулонефрит), скрытая пиурия. Для исследования патологического процесса в динамике. Для оценки эффективности проводимого лечения. Достоинства метода: технически прост, не требует большого кол-ва мочи и длитель. его хранения, применяется в амбулаторной практике. Обяз. условия : утренняя моча, средняя порция, кислая р-ция (в щелочной может быть частичный расспад клеточных элементов). 1. Перемешивают мочу.2.В мерную центрифужную пробирку помещают 10 мл мочи и центрифугируют 10 мин 1500 об/мин. 3. После центриф. отсасыв. Пипеткой верхнюю часть жидкости, оставл. ровно 1 мл осадка. 4.Осадок тщательно перемешивают и заполняют камеру Горяева. 5. Через 3-5 мин после заполн, приступают к подсчёту форменных элементов. 6.Подсчёт лейкоцитов,Er, цилиндров с окуляром 15 объективом 8 при опущ. конденсоре, в 100 больших квадратах камеры. Считают отдельно лейкоциты, Er, цилиндры (счит. не менее 4 камер Горяева) выводят сред. ариф. Х=А х 0,25х 10 6 /л. Норма: лейк. 2-4х 10 6 /л, Er до 1 х 10 6 /л, цилиндров до 0,02 х 10 6 /л (один на 4 камеры). У детей: лейк. до 2-4х 10 6 /л, Er до 0,75 х 10 6 /л, цилиндров до 0,02 х 10 6 /л.

15. Исследование мочи по Зимницкому

Этой пробой устанавливают способность почек концентр. и разводить мочу. Сущность пробы закл. в динамическом определении относительной плотности и кол-ва мочи в трёхчасыв порциях в течение суток. Проведение пробы: после опорожнения мочевого пузыря в 6 часов утра в унитаз, пациент через каждые три часа собирает мочу в отдельные банки в течение суток. Всего 8 порций. Ход исслед.: 1. Доставл. Мочу расставляют по часам и в каждой порции определяют кол-во и относительную плотность. 2. Сравнивают суточное кол-во мочи и кол-во выпитой жидкости, чтобы опред. % её выведения. 3. Вычисляют дневной и ночной диурез, суммируют, получают суточный диурез. 4. Устанавливают диапазон колебаний кол-ва и относительн. плотности мочи за сутки т.е. какова разница между самой малой порцией и большой. Показ. пробы у здор. людей: 1. Суточный диурез 800-1500 мл. 2. Дневной диурез значительно преобладает над ночным. 3.Колебания объёма мочи в отдельных порциях значительные (от 50 до 400 мл). 4. Колебания р от 1,003 до 1,028, должно быть более 0,008. При функ. недостаточности почек: гипостенурия, гипоизостенурия, изостенурия, гиперстенурия, олигурия, анурия, никтурия.

16. Описание общих свойств кала.

В норме кал состоит из продуктов секреции и экскреции пищеварит тракта, остатков неперевар или частично перевар пищевых продуктов, микробной флоры. Количество кала 100-150 г. Консистенция-плотная. Форма-цилиндрическая. Запах-каловый обычный. Цвет-коричневый. Р-ция- нейтральная, слабощелочная или слабокислая (рН 6,5-7,0-7,5). Слизь-отсутствует. Кровь-отсутствует. Остатки непереваренной пищи-отсутствует.

Определение СОЭ.

Водный р-р цитрата натрия 5%, объём крови 1:4. Набирают целый капилляр крови и смешивают с цитратом натрия(25 делений). Ставят в аппарат Панчекова на 1 час. Норма муж. 2-10 мм/ч, жен. 2-15 мм/ч. Ускоренная СОЭ-инф. воспал. процессы, лейкозы, злокачеств. новообразования. Замедление СОЭ-увеличение содержания альбуминов, желчных кислот.

Фиксация мазков крови.

Предохраняет форменные элементы крови от воздействия содержащейся в красках воды, под влиянием которой в нефиксированных препаратов происходит гемолиз эритроцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксатор также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле. Фиксаторы: метиловый спирт (3-5 мин), р-р эозинметиленового синего по Май-Грюнвальду, этиловый спирт 960 (30 мин), хлороформ (несколько секунд), формалин (1 мин), смесь Никифорова (20 мин). Фиксацию проводят в специальных контейнерах, опускаяиз в кювету с фиксаором.

Обнаружение белка в моче пробой Геллера.

Р-вы 50% азотная к-та, р-в ларионовой. Ход определения в пробирку 1-1,5 мл азотной к-ты или реактив ларионовой и по стенком наливают 1-1,5 мл мочи, при наличии белка появится белое кольцо, чувств пробы 0,033 г/л. Появление кольца через 2-3 минуты

2.Обнаружение белка в моче с 20% сульфосалициловой кислотой.

Р-в: р-р 20% сск: 20г сск растворяют в 70 мл дис воды и доливают до 100 мл. ход определения: в 2 пробирки налить 2-3 мл центрифугир мочи слабокислой реакции, в 1 пробирку налить 3-4 капли р-ра сск, во 2 в нее приливают 2 мл дис воды. при наличии белка в пробирке с реактивом появл мутность или выподают хлопья, контрольпробирки остается прозрачным. Минимал кол-во белка в этой пробе 0,015 г/л.

Небольшое количество белка в суточной моче обнаруживается и у вполне здоровых лиц, однако такие небольшие концентрации не выявляют в разовых порциях используемыми в настоящее время методами. Приблизительно 70% белков мочи здорового человека приходится на долю уромукоида - белка, являющегося продуктом почечной ткани; таким образом, доля гломерулярного белка в моче здоровых людей является ничтожно малой и протеинурия в норме составляет 50-150 мг/сут, причем большинство белков мочи идентично сывороточным.

Принято различать следующие формы протеинурии в зависимости от места возникновения: преренальную, связанную с усиленным распадом белка тканей, выраженным гемолизом; ренальную, обусловленную патологией почек, которая может быть разделена на клубочковую и канальцевую; постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей и чаще всего обусловленную воспалительной экссудацией.

В зависимости от длительности существования выделяют постоянную протеинурию, существующую в течение многих недель и даже лет, и преходящую, появляющуюся периодически, иногда даже при отсутствии патологии почек, например при лихорадке и выраженной интоксикации.
Целесообразно различать вариабельность протеинурии: при суточной потере белка до 1 г - умеренную, от 1 до 3 г - среднюю и более 3 г - выраженную.

Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи. Наиболее точны методы электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле. По результатам, полученным этими методами, можно судить о селективности протеинурии.

Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты); если есть способ измерить интенсивность коагуляции, то проба становится количественной.

Унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой:

Необходимый реактив:

20%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

Ход исследования:

В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи.
В опытную пробирку прибавляют 6-8 капель реактива. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, пробу считают положительной.

Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют 2-3 каплями 10%-ного раствора уксусной кислоты.

Унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова:

В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.

Необходимый реактив:

30%-ный раствор азотной кислоты (относительная плотность 1,2) или реактив Ларионовой. Приготовление реактива Ларионовой: 20-30 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты.

Ход исследования:

В пробирку наливают 1-2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают такое же количество профильтрованной мочи.
Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2 и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т.е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком - в 4 раза, при компактном - в 8 раз и т.д. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на 1 л (г/л).

Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца уратное появляется немного выше границы между двумя жидкостями и растворяется при легком нагревании.

Количественное определение белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты:

Принцип метода:

Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Необходимые реактивы:

1.
3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

2. 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

3. Стандартный раствор альбумина - 1%-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором. Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев.

Специальное оборудование - фотоэлектроколориметр.

Ход исследования:

В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм. Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице.

Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы.

Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете.

Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Биуретовый метод:

Принцип метода:

Пептидные связи белка с солями меди в щелочной с образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.

Необходимые реактивы:

1. 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 20%-ный раствор меди (CuSO4∙5H2O).
3. 3%-ный раствор NaOH.

Ход исследования:

К 5 мл мочи, взятой из суточного количества, прибавляют 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок затем растворяют в 5 мл раствора NaОН. К раствору добавляют 0,25 мл CuSO4, смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочной кривой, при построении которой на оси ординат откладывают концентрацию белка (г/л), а на оси абсцисс - оптическую плотность в единицах экстинкции. По полученной концентрации рассчитывают суточную потерю белка с мочой.

С помощью индикаторной бумаги (полосок):

Белок может быть обнаружен с помощью индикаторной бумаги (полосок), которые выпускаются фирмами “Albuphan”, “Ames” (Англия), “Albustix”, “Boehringer” (Германия), “Comburtest” и др.

Принцип основан на феномене так называемой протеиновой ошибки некоторых кислотно-щелочных индикаторов. Индикаторная часть бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером. При увлажнении бумаги буфер растворяется и обеспечивает соответствующий рН для реакции индикатора.

При 3,0-3,5 аминогруппы белков реагируют с индикатором и меняют его первоначально желтую окраску на зеленовато-синюю, после чего, сравнивая с цветной шкалой, можно ориентировочно оценить концентрацию белка в исследуемой моче. Основной предпосылкой правильной работы индикаторных полосок является обеспечение pH в диапазоне 3,0-3,5 для протекания реакции.

Если бумага находится в контакте с исследуемой мочой дольше экспозиции, указанной в инструкции, то цитратный буфер в ней растворяется, и тогда индикатор реагирует на истинный рН мочи, т.е. дает ложноположительную реакцию. В связи с тем, что емкость буфера ограничена, то даже при соблюдении методических указаний в пробах слишком щелочной мочи (pH > 6,5) получаются ложноположительные результаты, а в пробах слишком кислой мочи (рН
Число реагирующих аминогрупп в составе отдельных белков различно, поэтому альбумины реагируют в 2 раза интенсивнее, чем такое же количество γ-глобулинов (белок Бенс-Джонса, парапротеины), и гораздо интенсивнее, чем гликопротеиды. Однако при большом количестве слизи с высоким содержанием гликопротеидов (при воспалении мочевыводящих путей) оседающие на индикаторной полоске хлопья слизи могут давать ложноположительные результаты.

Чувствительность отдельных производственных серий индикаторной бумаги, равно как и отдельных видов бумаги, выпускаемых одной и той же фирмой, может быть различной, поэтому к количественной оценке белка этим методом следует относиться осторожно. Определение суточной потери белков с мочой при помощи индикаторной бумаги невозможно. Таким образом, индикаторная бумага уступает химическим пробам, в первую очередь пробе с сульфосалициловой кислотой, хотя и дает возможность быстрого исследования серии образцов.

Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса:

Белок Бенс-Джонса может выделяться с мочой при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема.

Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Индикаторная бумага для обнаружения белка Бенс-Джонса непригодна.

Принцип:

Основан на реакции термопреципитации. Методы, с помощью которых оценивают растворение белка Бенс-Джонса при температуре 100 °С или повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как далеко не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Наиболее достоверно выявление этого парапротеина осаждением его при температуре 40-60 °С, но и в этих условиях осаждение может не произойти в слишком кислой (рН 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и при низкой концентрации белка Бенс-Джонса.

Необходимый реактивы:

2 М ацетатный буфер рН 4,9.

Ход исследования:

Профильтрованную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл буфера и согревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белков Бенс-Джонса уже в течение 2 мин появляется выраженный осадок, при концентрации белка Бенс-Джонса менее 3 г/л проба может получиться отрицательной. На практике это встречается крайне редко, так как большей частью концентрация белка Бенс-Джонса в моче значительная.

С полной достоверностью белок Бенс-Джонса может быть обнаружен иммуноэлектрофоретическим исследованием при использовании специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

Определение альбумоз (протеоз):

Альбумозы - это продукты расщепления белков, принцип определения которых основан на том, что они не сворачиваются при кипячении, но дают положительную биуретовую реакцию и высаливаются некоторыми солями, особенно сульфатом аммония и ацетатом цинка в кислой среде.

Нормальная моча альбумоз не содержит. Следы могут быть в нормальной моче в случае примеси семенной жидкости. В патологии альбумозы могут встречаться в моче при лихорадочных состояниях, переливании крови и плазмы, рассасывании экссудатов и транссудатов, распаде опухолей.

Необходимые реактивы:

1. Насыщенный раствор хлорида натрия.
2. Концентрированный раствор едкого натра.
3. Слабый раствор сульфата меди (почти бесцветный).

Ход исследования:

К моче, подкисленной уксусной кислотой, прибавляют насыщенный раствор хлорида натрия (1/3 объема), кипятят и горячую жидкость фильтруют. Альбумозы проходят в фильтрат, в котором их присутствие определяют биуретовой реакцией. К фильтрату прибавляют 1/2 объема концентрированного раствора едкого натра и несколько капель слабого раствора сульфата меди. При положительной пробе получается красно-фиолетовое окрашивание.

При положительной пробе с сульфосалициловой кислотой мочу нагревают. Если муть исчезает и вновь появляется при охлаждении, это означает, что моча содержит альбумозы или белковое тело Бенс-Джонса.

Проба имеет чувствительность 0,033 г/л и используется в клинической диагностике протеинурии . Принцип выявления белка основан на его денатурации под воздействием денатурирующего фактора - концентрированной азотной кислоты или реактива Ларионовой .

Следует отметить, что в моче всегда присутствует некоторое количество белка, но, как правило, его концентрация в моче здорового человека ниже порога чувствительности качественной реакции и не выявляется простыми методами. Для количеств белка свыше 0,033 г/л проба непригодна. При более высоких концентрациях необходимо разбавлять мочу или использовать альбуминометр Эсбаха.

Для определения количества общего белка в моче используются метод, основанный на пробе Геллера - метод Брандберга-Робертса-Стольникова (W. Roberts, 1830-1899, англ. терапевт). Методика предполагает разведение мочи до нижнего предела чувствительности пробы (0,033 г/л) и времени образования кольца в 2-3 минуты.

Ход выполнения анализа

Реактивы: концентрированная (дымящаяся) азотная кислота или реактив Ларионовой. Исследуемая моча должна быть прозрачной и иметь кислую реакцию.

Приготовление реактива Ларионовой

Приготавливают насыщенный раствор хлорида натрия (20-30 г соли растворяют в 100 мл теплой воды, дают отстояться до охлаждения). Надосадочную жидкость сливают и фильтруют. К 99 мл фильтрата добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты (можно заменить 2 мл соляной кислоты).

Техника исследования

В пробирку с 1-2 мл реактива осторожно по стенке наслаивают примерно такое же количество мочи. При наличии белка, примерно через 2-3 минуты, на границе раздела жидкостей наблюдается помутнение - белое кольцо из денатурировашего белка.

Ложноположительный результат может появиться при использовании азотной кислоты, за счет высокой концентрации нуклеоальбуминов или солей уратов. В первом случае оно исчезает при легком покачивании пробирки, а во втором кольцо располагается значительно выше границы раздела сред и исчезает при нагревании; при повторении пробы с разбавленной мочой кольцо не образуется. Иногда также появляется коричневатое пигментное кольцо от окисления урохрома азотной кислотой.

Использование реактива Ларионовой, в отличие от азотной кислоты, имеет ряд преимуществ: на границе наслоения не образуется пигментных колец, а положительный результат дает более четкие белковые кольца.

См. также

Напишите отзыв о статье "Проба Геллера"

Ссылки

Литература

К:Википедия:Статьи без изображений (тип: не указан)

Отрывок, характеризующий Проба Геллера

Граф опять пошел за перегородку и лег. Графиня подошла к Наташе, дотронулась перевернутой рукой до ее головы, как это она делала, когда дочь ее бывала больна, потом дотронулась до ее лба губами, как бы для того, чтобы узнать, есть ли жар, и поцеловала ее.
– Ты озябла. Ты вся дрожишь. Ты бы ложилась, – сказала она.
– Ложиться? Да, хорошо, я лягу. Я сейчас лягу, – сказала Наташа.
С тех пор как Наташе в нынешнее утро сказали о том, что князь Андрей тяжело ранен и едет с ними, она только в первую минуту много спрашивала о том, куда? как? опасно ли он ранен? и можно ли ей видеть его? Но после того как ей сказали, что видеть его ей нельзя, что он ранен тяжело, но что жизнь его не в опасности, она, очевидно, не поверив тому, что ей говорили, но убедившись, что сколько бы она ни говорила, ей будут отвечать одно и то же, перестала спрашивать и говорить. Всю дорогу с большими глазами, которые так знала и которых выражения так боялась графиня, Наташа сидела неподвижно в углу кареты и так же сидела теперь на лавке, на которую села. Что то она задумывала, что то она решала или уже решила в своем уме теперь, – это знала графиня, но что это такое было, она не знала, и это то страшило и мучило ее.
– Наташа, разденься, голубушка, ложись на мою постель. (Только графине одной была постелена постель на кровати; m me Schoss и обе барышни должны были спать на полу на сене.)
– Нет, мама, я лягу тут, на полу, – сердито сказала Наташа, подошла к окну и отворила его. Стон адъютанта из открытого окна послышался явственнее. Она высунула голову в сырой воздух ночи, и графиня видела, как тонкие плечи ее тряслись от рыданий и бились о раму. Наташа знала, что стонал не князь Андрей. Она знала, что князь Андрей лежал в той же связи, где они были, в другой избе через сени; но этот страшный неумолкавший стон заставил зарыдать ее. Графиня переглянулась с Соней.
– Ложись, голубушка, ложись, мой дружок, – сказала графиня, слегка дотрогиваясь рукой до плеча Наташи. – Ну, ложись же.
– Ах, да… Я сейчас, сейчас лягу, – сказала Наташа, поспешно раздеваясь и обрывая завязки юбок. Скинув платье и надев кофту, она, подвернув ноги, села на приготовленную на полу постель и, перекинув через плечо наперед свою недлинную тонкую косу, стала переплетать ее. Тонкие длинные привычные пальцы быстро, ловко разбирали, плели, завязывали косу. Голова Наташи привычным жестом поворачивалась то в одну, то в другую сторону, но глаза, лихорадочно открытые, неподвижно смотрели прямо. Когда ночной костюм был окончен, Наташа тихо опустилась на простыню, постланную на сено с края от двери.
– Наташа, ты в середину ляг, – сказала Соня.
– Нет, я тут, – проговорила Наташа. – Да ложитесь же, – прибавила она с досадой. И она зарылась лицом в подушку.

Кольцевая проба Геллера помогает проанализировать белковую составляющую мочи. Данный метод, разработанный Иосифом Геллером, базируется на физико-химическом процессе слипания. Для мочи требуется определенное состояние: при исследовании нужен прозрачный образец , который обладает кислой реакцией.

Для исследования используется концентрат азотной кислоты HNO3. Также под данный метод подойдет реактив Ларионовой. Чтоб изготовить его, подготавливается раствор хлористого натрия в концентрированном состоянии: двадцать пять миллиграмм соли добавляют в сто миллилитров воды.

Далее жидкость нагревают, при этом происходит полное растворение соли . После того, как раствор остывает, надосадочную составляющую удаляют и девяносто девять миллилитров объединяют с одним миллилитром концентрата HNO3. Его также можно заменить двумя миллилитрами концентрата хлористоводородной кислоты.

Алгоритм проведения

Для пробы Геллера потребуется пробирка, в которую помещается реактив в объеме от одного до двух миллилитров. Далее очень осторожно по стенке сосуда добавляется исследуемая моча в равной пропорции с реактивом. По прошествии трех минут взаимодействия присутствие белка проявится в виде мутной пограничной линии между мочой и реактивом. Это кольцо и является белковым денатуратом.

Ложный положительный эффект изучения может возникнуть в случае применения азотной кислоты, а также при большом количестве нуклеоальбуминов или же солей уратов. В первой ситуации кольцо растворяется, если слегка встряхнуть пробирку. Вторая ситуация предполагает наличие кольца, которое будет локализоваться немного выше разделяющей черты. Оно растворяется при повышении температуры жидкости. В некоторых случаях возникает кольцо коричневого окраса, это результат окисления урохрома азотной составляющей.

Сравнивая эффект от применения HNO3 и реактива Ларионовой, хочется отметить второй вариант как более точный. Он обладает рядом преимуществ:

• Реактив Ларионовой не дает при анализе пигментные кольца.
• Белковые кольца проявлены более четко, чем с использованием метода Геллера.
• Сохраняется азотная кислота.
• Реактив не так опасен и, оказываясь на ткани, не прожигает ее.

Минусы при использовании пробы

1. Использование пробы Геллера — довольно сложный процесс, для которого требуется довольно много времени, а также концентрат азотной кислоты.
2. Может возникать пигментное кольцо коричневого окраса, что препятствует выявлению белка.
3. В материале, в котором есть соль мочевой кислоты, может образовываться белое кольцо, располагающееся значительно выше линии, которая разделяет жидкости.
4. Также исследование способно давать ложные положительные результаты в случае большого количества мочевой кислоты.

Альтернатива

Быстрый и более простой способ определения белка в моче — с помощью специальной бумаги, которая является индикатором.

В этом варианте исследования в материал погружается бумажная полоска, которая содержит в себе особую пропитку, благодаря чему индикаторная бумага при контакте с мочой приобретает цвет в диапазоне от желтого к синему. Оттенок указывает концентрацию белка. Существует шкала, по которой можно сделать данное заключение.

Для того чтобы результат был максимально точным, следует придерживаться некоторых правил:

• рН материала должен находиться на отметке от 3,0 до 3,5 . Большое количество щелочи даст ложный положительный результат, а в случае большого количества кислоты в моче – ложный отрицательный.
• Бумажный индикатор не должен контактировать с материалом больше положенного времени. Иначе результат будет необъективным.
• Также при слишком большом количестве слизи может быть ложный положительный результат.
• В зависимости от бумаги и ее производителя чувствительность индикатора может быть разной. Так что не следует полностью полагаться на данный тест в отношении содержания белка в моче.
• Суточная моча не может показать количество белка.